無血清培養基(Serum-Free Media)介紹

通常，動物細胞的生長均有賴于血清的存在，在普通培養基中，如不加血清，絕大部分細胞不能增殖。目前，血清培養基中通常添加的比較好的血清是牛血清。經研究發現細胞培養中使用牛血清存在污染外源病毒和致病因子的風險：由于不同批次牛血清間的生物活性和因子的不一致，導致產品和實驗結果的重現性差：制品中殘留的牛血清易引起接種者對血清的過敏反應。

　　無血清培養基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細胞培養中不需要添加血清，但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子。無血清培養基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養物質和激素等，能減少血清帶來的不利因素，使細胞培養的條件更穩定。經歷了天然培養基、合成培養基后，無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可簡化純化和鑒定各種細胞產物的程序，避免病毒污染造成的危害。

一、無血清細胞培養基及其優缺點

(一)無血清培養基及分類

　　無血清培養基是繼天然培養基，合成培養基之后的第三類培養基。與傳統的培養基相比較，無血清培養基是不含動物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細胞在體外較長時間生長、繁殖的一種培養基。無血清培養基由于其組成成分相對清楚，制備過程簡單，在現代生物技術學領域得到廣泛應用。無血清培養技術也是闡明細胞生長，增值，分化及基因表達調控的基礎研究問題的有力工具。

　　目前，無血清培養基的研究有兩個方向：一是培養基中不含有任何動物來源的添加組分;二是培養基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當前應用較多的無血清培養基歸納為以下四種：

1.一般意義上的無血清培養基，用各類可代替血清功能的生物材料配制細胞培養基，如牛血清白蛋白(BSA)，轉鐵蛋白，胰島素等生物大分子物質，以及從血清中提取的去除蛋白質的混合脂類以及水解蛋白等。其特點是培養基中的蛋白含量較高，添加物質的化學成分不明確，其中含有大量的動物來源蛋白。

2.無動物來源培養基：許多商業公司開發的無動物來源培養基是基于生產重組藥物的安全考慮，培養基中的添加組分無動物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細胞生長及增殖的需要。

3.無動物蛋白培養基：培養基完全不用動物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養基組分相對穩定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養的細胞是高度特異性的。

4.化學組分限定培養基，此類培養基是目前最安全的，最為理想的培養基，首先可以保證培養基批次間的一致性，其中所添加的少量動物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組分。其特點是培養基的性質確定，配起培養基來也比較方便。

(二)無血清培養基的優缺點

無血清培養基的優點：

1. 可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養和實驗結果的重復性。

2. 避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3. 避免血清組分對實驗研究的影響。

4. 有利于體外培養細胞的分化。

5. 可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。

6. 組分穩定，可大量生產。

7. 不含有絲分裂原抑制劑，可以促進細胞增殖。

無血清培養基的缺點：

⒈ 細胞在無血清培養基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養基的保存和應用不 如傳統的合成培養基方便。

2. 成本較高。

3. 針對性很強，一種無血清培養基僅適合某一類細胞的培養。

4. 處于發育的不同分化階段的細胞(例如干細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時，也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。

二、無血清培養基組成及主要添加因子

　　無血清培養基由營養完全的基礎培養基添加激素，生長因子，貼壁因子和結合蛋白而組成。

(一)基礎培養基

　　早期用于細胞培養的基礎培養基有血漿凝塊，淋巴液，大豆蛋白胨和胚胎浸膏等天然培養基。1950年Morgan等在前人的研究基礎上研究出199培養基，是動物細胞培養基發展到一個嶄新的階段，及合成培養基階段。合成培養基是按細胞生長需要將一定比例的氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖等組合成的基礎培養基。目前市場上已經有上百種的合成培養基商品。在眾多的合成培養基中，MEM、DMEM、RPMI 1640、F12、和TC100的使用最為廣泛。

　　基礎培養基的成分是完全已知的，因此在對不同的細胞株進行培養時可以對基礎培養基的某些組分進行相應的調整，以更好的符合細胞株的營養要求或提高目的蛋白的表達量。

(二)主要添加因子

　　又稱補充因子，是代替血清的各種因子的總稱。多數無血清培養液必須補加3—8種因子，任何單一因子都不能取代血清。已知有100多種此類因子，其中有些是必須補充因子，如胰島素、亞硒酸鈉和轉鐵蛋白，其他多數為輔助作用的因子。

　　按其功能不同，我們可將補充因子分為四類：

1.激素和生長因子

　　很多細胞用無血清培養時需要加入激素，如胰島素、生長激素、胰高糖素等。幾乎所有的細胞系都需要胰島素，它是一種多肽，能與細胞上的胰島素受體結合形成復合物，促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，一致細胞凋亡，是重要的細胞存活因子。細胞無血清培養中，胰島素的使用濃度為0.1-10μg/ml。Jan等認為在批式培養中胰島素迅速耗盡是細胞比生長速率下降的主要原因。此外甲狀腺素等和甾體類激素中的孕酮、氫化可的松、雌二醇等也是無血清細胞培養是常用的補充因子。不同細胞株對激素的種類和數量要求有所不同。

　　生長因子是維持細胞體外培養生存、增殖和分化所必需的補充因子。按化學性質可分為多肽類生長因子和甾類生長因子。無血清培養基中添加的生長因子主要是多肽類生長因子，近些年已鑒定的多肽類生長因子已有20-30種，其中半數以上都可以通過基因重組的手段獲得相應的重組生長因子。無血清培養基較常見的生長因子有表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和神經生長因子(NGF)等。生長因子是有效的促有絲分裂原，能縮短細胞群體倍增時間。

2.結合蛋白

　　結合蛋白有兩種，一種是轉鐵蛋白，另一種是白蛋白。

　　大多數哺乳動物細胞上存在特定的轉鐵蛋白受體，受體與轉鐵蛋白與鐵離子的復合物結合是細胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源，此外轉鐵蛋白還具有生長因子的性質并能與其他微量元素如釩等結合。不同細胞對轉鐵蛋白的需要量也不同。

　　白蛋白也是無血清培養基中常用的添加因子。它通過與維生素、脂類、激素、金屬離子和生長因子的結合而穩定和調節上述物質在無血清培養基中活性的作用，此外還有結合毒素和減輕蛋白酶對細胞影響的作用。

3.貼壁因子

　　絕大多數的真核細胞在體外生長時需要固著在適宜的基底上。細胞固著作用是一個復雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿或載體的表面。細胞與貼壁因子的結合等。無血清培養中常用的貼壁因子有細胞間質和血清中的成分，如纖粘連蛋白、膠原、昆布氨酸和多聚賴氨酸等。

4.其他添加因子

　　一些細胞系的無血清培養還需要補充某些低分子量的化學物質，如微量元素、維生素、脂類等，維生素B主要以輔酶的形式參與細胞代謝，維生素C和維生素E具有抗氧化作用。丁二胺和亞油酸等提供細胞膜合成所需的脂質和細胞生長所需的水溶性脂質。

三、無血清培養基的應用

　　目前在大規模動物細胞的培養中已經普遍適用于無血清培養基。在疫苗生長、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應用領域中，優化無血清培養基的成分可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目的產物的環境中維持高密度培養，降低生產成本。在人類細胞培養中，應用無血清培養基還能有選擇性地控制及避免成纖維細胞的過度生長。在無血清培養條件下，某些細胞的生長量和抗體的產量甚至較有血清時高出數倍。

　　除生產生物制品外，無血清培養基也被廣泛應用于細胞生物學、藥理學、腫瘤學領域：

(1)研究細胞的分化條件：無血清培養基其組成可以是完全確知的化學物質，因而可根據研究的需要增減具有重要生物活性物質的種類和數量。這就為研究細胞分化的條件提供了有效的手段。

(2)用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究。

(3)用于從多種細胞混雜的培養中選擇目的細胞：通過對無血清培養中的某些成分的取舍，可抑制原代組織培養物中非目的細胞的過度生長，達到選擇目的細胞的目的。

(4)腫瘤病理學和病因學的研究：如用于研究致癌因子對細胞的影響，研究腫瘤細胞對可能觸發正常細胞終末分化的外周信號的反應能力，或用于研究正常細胞與腫瘤細胞的生長和移行與基底膜信號的關系等。

(5)無血清培養基在生物制品生產中的得到廣泛應用，國內外的很多生產單位都在致力于如何將無血清培養基與發酵罐培養技術更好的結合應用。

　　另外，無血清培養基還廣泛應用于干細胞和免疫細胞的研究和臨床治療中。且在此領域對無血清培養基的需求量最大而且最迫切。