DNA和RNA定量方法的選擇

DNA和RNA定量方法的選擇

新一代測序（NGS）實驗中，我們需要將精確量的DNA文庫分子上樣到測序儀中。如果測序運行時的文庫分子過多或過少，都會使數據質量受損。這不僅浪費寶貴的樣本和試劑，也浪費我們和儀器的時間。對于芯片分析（Microarray）和實時定量PCR（qPCR）而言，精確測定樣本中的DNA或RNA也是必需的。

以往我們大多采用分光光度計來測定260 nm處的吸光度，對DNA和RNA進行定量。盡管這種方法被廣泛采用，但并不意味著它的讀數是準確而可靠的。紫外吸光度測量不具有選擇性，無法區分DNA、RNA或蛋白質。而一些游離核苷酸或多余的鹽離子也會影響檢測的數值。此外，紫外分光光度計的靈敏度不足，無法完成低濃度DNA和RNA的精確定量。

Qubit 熒光定量儀采用熒光染料與特異的靶分子結合，只有當熒光染料與樣本中的特異分子（DNA或RNA或蛋白質）結合時，才會發出熒光信號，從而大大提升了研究的準確性。并不是要推qubit 熒光定量儀，而是Qubit 的精準、靈敏等性能滿足了新一代測序（NGS）實驗。也就是說qubit 的誕生是必然的，qubit 熒光定量儀的與時俱進讓它在新一代測序（NGS）實驗中成為佼佼者，qubit 時代已經到來！

DNA或RNA的選擇性PK

研究人員曾經做過實驗，使用DNA和RNA含量相同的樣本，利用qubit dsDNA BR 分析試劑盒測定其中DNA的濃度，結果發現測量結果在實際含量的的±2%范圍內，足以證明qubit的厲害。之后，他們使用了RNA含量比DNA高10倍的樣本，發現測得的DNA濃度僅比實際值高7%。再來看看分光光度計的表現吧。研究人員發現它們無法準確測定上述樣本中DNA和RNA的含量（圖下圖）。好吧，第一回合qubit獲勝。

上圖中，用qubit dsDNA BR和qubit RNA BR分析試劑盒及qubit熒光計，按照試劑盒實驗方案檢測含有lamBDa DNA (10 ng/μL)和不同量的大腸桿菌核糖體RNA (0-100 ng/μL)的樣本，每個樣品重復3次。然后采用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測同一樣本三次，采用Perkinelmer LamBDa 35分光光度計檢測一次。標示的濃度是在qubit®分析管中稀釋前起始樣本的DNA和RNA濃度。紅色和橙色趨勢線分別表示起始樣本中DNA和RNA的實際含量。

低濃度下的準確性PK

研究人員之后采用qubit® dsDNA HS分析試劑盒及qubit® 熒光計，定量濃度僅為10 pg/μL的樣本中的DNA，發現測得值在實際值的±12%范圍內。而采用分光光度計測量上述相同樣本，測得的濃度比實際值高46倍。而對于10 ng/μL的樣本，qubit® 測得值在實際值的±1%范圍內，而分光光度計測定的濃度在實際值的±5%范圍內（如圖）。顯然，在樣本濃度低的情況下，使用qubit® 更為合適。

上圖中，qubit® 熒光定量的準確度和精度。根據標準試劑盒實驗方案，在qubit® 熒光計中采用qubit® dsDNA HS分析試劑盒重復10次測量濃度在0.01至10 ng/μL之間的lamBDa DNA。同時采用NanoDrop® ND-1000分光光度計重復10次測量相同濃度的DNA，比較結果的準確度(A) 和精度(B)。

樣本濃度范圍PK

qubit 的配套試劑盒有很多種，分別適合dsDNA、ssDNA、RNA、microRNA和蛋白質。其中，雙鏈DNA分析試劑盒又分為高靈敏度（HS）和寬范圍（BR）兩種，適合10pg/μL至1μg/μL的DNA。與之類似，qubit RNA HS和BR分析試劑盒覆蓋的樣本濃度范圍在250 pg/μL至1 μg/μL。而分光光度計的檢測范圍通常在2 ng/μL至15 μg/μL（如圖）。由此可見，qubit 適合的濃度范圍更寬，不過，高濃度樣本在分光光度計上測定就不必稀釋。 

上圖中. qubit®分析與采用NanoDrop®分光光度計進行紫外吸光度檢測的樣本濃度范圍比較

其他方面PK

當然，分光光度計也有它的優勢。全光譜吸光度讀數可以通過吸收峰顯示是否有污染物存在。另外，它的使用成本較低，上樣、測定、擦拭即可，幾乎不需要消耗品。而qubit® 則需要購買配套的分析試劑盒。